Nuair a bhain tú céim amach agus nuair a chuaigh tú isteach sa phost, beidh tú ag tabhairt aghaidhe ar chúpla ainmfhocal agus tú ag tabhairt aghaidh ar thurgnaimh chainníochtúla PCR fíor-ama. An bhfuil mearbhall ort faoin áit le tosú? Cad is brí le cuar aimpliúcháin, cuar caighdeánach, tairseach, luach CT, cuar leá agus bunlíne? Tá na híomhánna fluaraiseacha ó na turgnaimh sin ró-gheal, ach is cosúil nach féidir liom iad a aithint. Sa lá atá inniu, tabharfaimid orainn tú chun an t-eolas agus na coincheapa seo a fhoghlaim ina dhá chuid: téarmaí teicniúla agus ceisteanna coitianta.
Cuid I Téarmaí Gairmiúla
1. Cuar aimpliúcháin
Tagraíonn an cuar aimpliúcháin don chuar ina bhfuil an uimhir thimthriall an abscissa agus is é an déine fluaraiseachta fíor-ama le linn an imoibrithe an t-ord le linn an PCR.
2. Bunlíne
Tagraíonn bunlíne d'athrú beag ar chomhartha fluaraiseacha le linn an chéad chúpla timthriall d'imoibriú aimplithe PCR. Léiríonn an leibhéal comhartha gar do líne dhíreach, arb é an bunlíne é.
3. Socrú tairsí fluaraiseachta
De ghnáth, úsáidtear an comhartha fluaraiseachta den chéad 15 timthriall den imoibriú PCR mar chomhartha cúlra fluaraiseachta, agus tá an tairseach fluaraiseachta 10 n-uaire an diall caighdeánach ar an comhartha fluaraiseachta le linn 3-15 timthriallta PCR, agus an tairseach fluaraiseachta. socraithe le linn na céime easpónantúla d'aimpliú PCR. De ghnáth, bíonn a tairseach fluaraiseachta ag gach ionstraim roimh úsáid.
4. Luach CT
Léiríonn an luach CT líon na dtimthriallta a tharlóidh do gach feadán imoibrithe PCR nuair a shroicheann an comhartha fluaraiseacha an tairseach socraithe. Ó thaighde, tá a fhios againn go bhfuil gaol líneach idir luach CT gach teimpléid agus logarithm uimhir chóip tosaigh an teimpléid sin. Dá airde an uimhir chóip tosaigh, is lú an luach CT, agus vice versa. Ag baint úsáide as caighdeáin a bhfuil na huimhreacha tosaigh atá ar eolas acu, is féidir cuar calabraithe a dhéanamh ina seasann an abscissa logarithm na cóipe tosaigh, agus seasann an t-ordanáid don luach CT. Dá bhrí sin, chomh fada agus a fhaightear luach CT an tsampla anaithnid, is féidir uimhir chóip tosaigh an tsampla a ríomh ón gcuar caighdeánach.
níos mó a fhios
Tá roinnt táscairí ann chun a mheas an bhfuil an cuar aimpliúcháin go maith nó nach bhfuil:
Freagra: Tá pointe infhillte an chuar soiléir, go háirithe go bhfuil an chéim easpónantúil den sampla codán íseal-trom soiléir, tá comhthreomharacht iomlán an chuar aimpliúcháin an-mhaith, tá an bunlíne cothrom, níl aon feiniméan ag ardú, agus an t-aimpliú. tá cuar an tsampla tiúchana céim easpónantúil ísealleibhéil an-mhaith. soiléir.
B: Tá fána chéim easpónantúil an chuar comhréireach go díreach leis an éifeachtúlacht aimplithe, is mó an fána, is airde an éifeachtacht aimpliúcháin.
C: Tá an bunlíne caighdeánach cothrom nó ag laghdú beagán, gan aon treocht aníos dealraitheach.
D: Tá comhthreomharacht na gcuar aimpliúcháin do gach feadán go maith, rud a léiríonn go bhfuil éifeachtacht aimplithe gach feadán imoibrithe cosúil.
5. Cuar leá
Nuair a théitear an táirge PCR, de réir mar a ardaíonn an teocht, dícheanglaíonn an táirge aimpliúcháin dhá-shnáithe de réir a chéile, rud a fhágann go laghdaítear déine fluaraiseachta. Nuair a shroichtear teocht áirithe, scarann líon mór táirge, rud a fhágann go bhfuil laghdú géar ar fhluaraiseacht. Trí úsáid a bhaint as an bhfeidhm seo mar aon le luachanna TM éagsúla do tháirgí PCR éagsúla, tá difríocht freisin sa teocht ag a laghdaíonn an comhartha fluaraiseacha go tapa, rud a d'fhéadfadh a bheith ina bhealach maith chun sainiúlacht PCR a aithint.
6. Cuar leá (ag baint úsáide as cuar logartamach)
Cruthaítear an buaicghraf trí logarithm an chuar leáigh chun staid na blúirí táirge a thaispeáint ar bhealach níos intuigthe. Ós rud é gurb é an teocht leá ná luach TM blúire DNA, is féidir paraiméadair áirithe a dhéanann difear do luach TM blúire DNA a chinneadh, mar shampla méid blúirí, ábhar GC, srl., De ghnáth, de réir ár bprionsabal dearadh primer, de ghnáth deirtear. go bhfuil fad an táirge aimplithe sa raon 80-300bp, agus ba cheart go mbeadh an teocht leá idir 80 céim agus 90 céim.
A: Mura bhfuil ach príomh-bhuaic amháin idir 80 céim agus 90 céim, ciallaíonn sé go bhfuil an PCR fíor-ama foirfe.
B: Más cosúil go bhfuil an buaic is mó idir 80 céim agus 90 céim, agus an chuma ar bhuaic eisíontais faoi bhun 80 céim, meastar go bunúsach an primer-dimer. Is rogha maith é seo chun iarracht a dhéanamh a réiteach tríd an teocht annealing a ardú.
C: Má tá an chuma ar an bpríomh-bhuaic idir 80 céim agus 90 céim, agus buaicphointe fánaíochta le feiceáil nuair a mhéadaíonn an teocht, breathnaítear go bunúsach ar éilliú DNA. Agus is gá an DNA a bhaint i gcéimeanna tosaigh an turgnaimh.
7. Líne cuar caighdeánach
Caolaíodh caighdeáin chaighdeánacha go tiúchain éagsúla agus úsáideadh iad mar theimpléid le haghaidh imoibrithe PCR. Déantar an cuar caighdeánach a bhreacadh le logarithm na huimhreach cóipe caighdeánach mar an abscissa agus an luach tomhaiste CT mar an t-ord. Agus sampla anaithnid á chainníochtú, is féidir uimhir chóip an tsampla a fháil ón gcuar caighdeánach bunaithe ar luach CT an tsampla anaithnid. Tá cuair chaighdeánacha an-tábhachtach maidir le cainníochtú iomlán.
an dara cuid. fadhb choitianta
C1: Cad é an difríocht idir RT-PCR, QPCR, PCR fíor-ama agus RT-PCR fíor-ama?
A1: Is é RT-PCR PCR trascríobh droim ar ais, a úsáidtear go forleathan d'imoibriú slabhra polaiméaráise. In RT-PCR, déantar an snáithe RNA a thras-scríobh ar ais go DNA comhlántach, a úsáidtear ansin mar theimpléad do PCR chun an DNA a mhéadú trí PCR.
Is é an rud céanna PCR agus QPCR fíor-ama, tá an dá PCR cainníochtúil fíor-ama, rud a chiallaíonn go bhfuil taifeadadh fíor-ama ar shonraí ag gach timthriall le linn an phróisis PCR. Ar an mbealach seo, is féidir líon na dteimpléad tosaithe a anailísiú go beacht.
Cé gur dealraitheach go ndéantar PCR fíor-ama agus PCR droim ar ais a ghiorrú mar RT-PCR, is é an coinbhinsiún idirnáisiúnta go dtagraíonn RT-PCR go sonrach do PCR droim ar ais-trascríobh, agus is minic a ghiorraítear PCR fíor-ama mar qPCR (Réalaíoch Cainníochtúil-. Fíor Fíor-Fíor PCR ) - PCR ama).
Is cineál de PCR trascríobh droim ar ais é RT-PCR fíor-ama (RT-QPCR) a chomhcheanglaíonn teicnící cainníochtúla fluaraiseacha: an chéad trascríobh droim ar ais ó RNA chun cDNA (RT) a fháil, agus anailís chainníochtúil ina dhiaidh sin ag baint úsáide as PCR fíor-ama (QPCR).
C2: Cén fáth a bhfuil fad na blúire táirge aimplithe de PCR cainníochtúla fluaraiseacha á rialú laistigh den raon 80-300bp?
A2: Tá fad gach seicheamh géine difriúil, tá cuid acu roinnt Kb agus na céadta BP. Nuair a bhíonn an primer á dhearadh againn, áfach, ní gá dúinn ach fad an táirge a bheith 80-300bp, agus níl sé ró-ghearr nó ró-fhada oiriúnach chun PCR a bhrath go cainníochtúil.
Tá blúirí táirge ró-ghearr chun idirdhealú a dhéanamh orthu ó primer-dimers. Timpeall 30-40bp atá an primer-dimer, nuair atá sé níos lú ná 80bp, is deacair idirdhealú a dhéanamh cé acu primer-dimer nó táirge é. Má tá an blúire táirge ró-fhada, níos mó ná 300bp, beidh sé mar thoradh go héasca ar éifeachtacht aimplithe íseal, agus ní féidir méid na géine a bhrath go héifeachtach.
Mar shampla, nuair a chomhaireamh tú líon na ndaoine i seomra ranga, ní gá duit ach a chomhaireamh cé mhéad béal atá ann. Tá an rud céanna fíor nuair a dhéantar tástáil ar ghéinte. Ní gá duit ach seicheamh áirithe géine a bhrath chun an seicheamh iomlán a léiriú. Tá sé éasca botún a dhéanamh má tá tú ag comhaireamh an dá bhéal agus na srón, na cluasa agus na spéaclaí chun daoine a chomhaireamh.
C3: Cad é an fad is fearr don dearadh primer?
A3: Go ginearálta, tá faid primer sa raon 20-24bp go maith. Ar ndóigh, ní mór dúinn aird a thabhairt ar luach TM an primer agus an primer á dhearadh, toisc go bhfuil baint aige leis an teocht annealing is fearr. Tar éis go leor turgnaimh, tá sé cruthaithe go bhfuil luach TM maith ag 60 céim. Is féidir aimpliú neamhshonrach a bheith mar thoradh go héasca ar theocht annealing íseal, agus de ghnáth bíonn éifeachtacht aimplithe íseal, buaic déanach an chuair aimpliúcháin agus luach moillithe CT mar thoradh ar theocht anáil ard.
Ceist 4: An mbíonn tionchar ag an méid sampla a bhailítear ar thorthaí an turgnaimh?
A4: Ní hea. Ar ndóigh, dá mhéad samplaí a bhailítear, is amhlaidh is mó RNA a bhaintear, is mó cDNA, agus na blúirí sprice níos mó a bheidh ann. Ar mhaithe le cainníochtú iomlán, is gá uimhir chóip an bhlúire sprice a ríomh, agus is cinnte go ndéanfaidh an méid sampla a bhailítear difear do thorthaí an turgnaimh. Mar shampla, is é a bhrath víreas heipitíteas C HBV san fhuil an t-ábhar HBV a bhrath i méid áirithe (1ml) fola.
Maidir le cainníochtú coibhneasta a úsáidtear go coitianta i dtaighde eolaíoch, níl aon bhaint ag líon na samplaí leis na torthaí turgnamhacha, toisc go dtagraíonn cainníochtú coibhneasta don chomparáid idir an spriocghéine agus an ghéin tagartha. Smaoinigh orthu le do thoil mar blúirí in aghaidh an tsrutha agus le sruth atá sa snáithe céanna aigéid núicléigh. Má tá méid an tsampla mór, méadaítear na géinte tagartha agus na sprice araon i gcomhréireanna comhionanna ag an am céanna, rud nach ndéanann difear do na torthaí.
C5: An ndéanfaidh éifeachtacht an transcriptase droim ar ais difear do na torthaí turgnamhacha?
A5: Mar an gcéanna thuas. Tabhair faoi deara gur mhaith linn éifeachtacht RT níos airde, ach is fearr linn an einsím RT a bheith sách cobhsaí agus torthaí aonfhoirmeacha a fháil. Beidh sé seo ina thástáil ar chumais optamaithe seomraí trascríobh droim ar ais na mórchuideachtaí.
Ceist 6: An ndéanann éifeachtúlacht einsím TAQ difear do thorthaí turgnamhacha?
A6: Tá éifeachtacht einsím TAQ sách mór. De ghnáth, tá gá le heinsímí taq te-túsaithe agus tá siad sách éifeachtach. Maidir le feisteáin chainníochtúla fhluaraiseachta tráchtála, déanfaidh gach monaróir éifeachtacht an staid is fearr a bharrfheabhsú de réir a gcuid táirgí féin gar do 100 faoin gcéad, má tá an éifeachtacht ró-íseal, ní féidir na torthaí turgnamhacha a fháil. I gcás táirgí cuideachtaí éagsúla, is tomhas cáilíochta é seo.
Ceist 7: An ndéanann an méid lí fluaraiseacha difear do na torthaí turgnamhacha?
A7: Sea, déanfaidh sé. Má tá an fluairochrome ró-sháithithe, féadfaidh sé cur isteach torainn a chur faoi deara i roinnt ionstraimí. Mura bhfuil an fluaracróm sáithithe, agus go bhfuil an luach fluaraiseachta ró-íseal, cuirfidh sé isteach céim ardchlár go luath agus beidh an cuar aimpliúcháin cothrom. Sa turgnamh cainníochtúil fluaraiseachta, tá an luach CT le feiceáil go príomha, agus mar sin níl sé tábhachtach go dtéann an cuar aimpliúcháin déanach isteach sa chéim Plateau, ach níl an pictiúr álainn go leor. Má bhí ort a roghnú, tosú ag roghnú fluaracróm atá beagán níos lú sáithithe. Mar sin féin, nuair a bhíonn an táirge céanna á úsáid ón gcuideachta chéanna, tá a éifeacht go bunúsach neamhbhríoch.
Ceist 8: An ndéanfaidh tarchur an fheadáin PCR difear do na torthaí turgnamhacha?
A8: Tá. Mar sin féin, don bhaisc chéanna d'earraí inchaite ón monaróir céanna, is féidir neamhaird a dhéanamh ar an éifeacht seo. Is rogha mhaith é seo agus is fearr 96-pláta tobair a úsáid le membrane ard-tréscaoilteachta chun éifeacht tarchur solais na n-ábhar inchaite a íoslaghdú.
C9: An ndéanfaidh earráidí le linn oibriú difear do thorthaí turgnamhacha?
A9: Tá tionchar an phróisis oibríochta léirithe go príomha san aonfhoirmeacht. Ciallaíonn aonchineálacht go bhfuil na comhpháirteanna uile sa chóras measctha go cothrom le chéile, agus is féidir le lártheifneoiriú flash an fhadhb seo a réiteach. Ina theannta sin, do thosaitheoirí, is fearr an córas PCR a choigeartú le bheith níos mó ná 20 orlach, agus tá córas ró-bheag níos mó seans maith ar earráidí. Má tá an teocht annealing optamaithe i gceart, íoslaghdaítear éifeacht tiúchan primer ar CT. Agus beidh a fhios agat gur féidir roinnt earráidí oibriúcháin (cosúil le tiúchan primer) a sheachaint tríd an teocht annealing a bharrfheabhsú.
Achoimre
Is iad seo thuas roinnt ceisteanna agus ceisteanna a bhíonn ag novices go minic le linn an turgnaimh, tá súil againn gur féidir leis na ceisteanna seo cabhrú leat a réiteach roinnt mearbhaill. Is éard atá i dturgnamh ná an próiseas chun anord a ghiniúint agus fadhbanna a réiteach, tá súil againn go mbainfidh tú rud éigin as. Go raibh maith agat as léamh agus feicfidh muid an chéad uair eile thú!